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Jan 01, 2024

CTCF é um DNA

Natureza volume 616, páginas

Nature volume 616, páginas 822–827 (2023)Citar este artigo

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2 Citações

121 Altmétrica

Detalhes das métricas

Em eucariotos, o DNA genômico é extrudado em loops pela cohesin1. Ao restringir esse processo, a proteína de ligação ao DNA CCCTC-binding factor (CTCF) gera domínios de associação topológica (TADs)2,3 que têm papéis importantes na regulação e recombinação gênica durante o desenvolvimento e a doença1,4,5,6,7. Como o CTCF estabelece os limites do TAD e até que ponto eles são permeáveis ​​à coesina não está claro8. Aqui, para abordar essas questões, visualizamos interações de moléculas simples de CTCF e coesina no DNA in vitro. Mostramos que o CTCF é suficiente para bloquear a difusão da coesina, possivelmente refletindo como a coesina coesiva se acumula nos limites TAD, e também é suficiente para bloquear a coesina extrusora de loop, refletindo como o CTCF estabelece os limites TAD. CTCF funciona de forma assimétrica, conforme previsto; entretanto, CTCF é dependente da tensão do DNA. Além disso, o CTCF regula a atividade de extrusão do loop da coesina, alterando sua direção e induzindo o encolhimento do loop. Nossos dados indicam que o CTCF não é, como previamente assumido, simplesmente uma barreira para a extrusão da alça mediada pela coesina, mas é um regulador ativo desse processo, pelo qual a permeabilidade dos limites do TAD pode ser modulada pela tensão do DNA. Esses resultados revelam princípios mecanísticos de como o CTCF controla a extrusão de loop e a arquitetura do genoma.

O dobramento do DNA genômico pela coesina tem papéis importantes na organização da cromatina, regulação gênica e recombinação1. A coesina pertence à família de manutenção estrutural dos cromossomos (SMC) de complexos ATPase que podem extrudar o DNA em loops, uma atividade que foi reconstituída in vitro para coesina, condensina e SMC5/SMC6 (refs. 9,10,11,12, 13,14). A coesina também desempenha uma segunda função mediando a coesão das cromátides-irmãs.

Nas células individuais, os loops estão localizados em posições variáveis, sugerindo que os loops são estruturas dinâmicas das quais a maioria está em processo de extrusão15,16,17. No entanto, nas medições da população celular, surgem padrões que revelam que a maioria dos loops é formada dentro dos TADs16,18,19. O CTCF está localizado nos limites do TAD18,19 e é necessário para sua formação e acúmulo de coesina nesses locais2,3,20. O CTCF possui regiões N- e C-terminais não estruturadas que flanqueiam 11 dedos de zinco, vários dos quais reconhecem uma sequência assimétrica de DNA e, portanto, posicionam o CTCF direcionalmente no DNA21,22. A maioria dos locais de ligação de CTCF são orientados em orientações convergentes de modo que os terminais N de CTCF estejam voltados para o interior de TADs, sugerindo que CTCF funciona como um limite assimétrico para extrusão de loop mediada por coesina23,24,25. Consistente com essa possibilidade, o terminal N do CTCF pode se ligar à coesina26 e é necessário para isolamento TAD e ancoragem de loop nesses locais26,27,28,29.

Vários mecanismos foram sugeridos para como o CTCF pode impedir a extrusão de loop através dos limites do TAD (revisado anteriormente8), a saber, como uma barreira física (bloqueio); por ligação à coesina; impedindo a liberação de coesina do DNA, promovendo a substituição da subunidade NIPBL ativadora de ATPase da coesina por sua contraparte inativa PDS5; pela inibição direta da atividade ATPase da coesina; e por promover o aprisionamento do DNA dentro de uma estrutura em anel formada por três das subunidades da coesina30. Também foi proposto que o CTCF converte a coesina em uma enzima de extrusão assimétrica, interrompendo a extrusão do loop no local ligado ao CTCF, permitindo que a coesina continue enrolando o DNA no loop apenas a partir do interior do TAD26,31,32. No entanto, permanece sem solução qual desses mecanismos propostos é usado pelo CTCF e se o CTCF é suficiente para bloquear a extrusão do loop pela coesina. Responder a essas perguntas é de grande importância, pois o CTCF é necessário para controlar as interações intensificador-promotor1, reprogramação nuclear6, recombinação de genes receptores de antígenos4,5 e o tempo de replicação do DNA33, e porque as mutações do CTCF foram implicadas na tumorigênese7. Os limites CTCF também são locais nos quais as moléculas de DNA replicadas são conectadas por complexos de coesina, que medeiam a coesão34.

<), tandem (>> and <<), and divergent (<>) manner. The percentages were obtained by multiplying the blocking probability of N- and C-terminal encounters in the force range 0.04-0.08 pN, as depicted in Fig. 2e, and normalizing to 100% (see Supplementary Note). Bar heights denote mean values. Error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2e. The relative fraction of CTCF-anchored loops that we obtained from the single-molecule experiments are compared to published values extracted from Hi-C data3,63,64,65. b, Stalling force of cohesin. horizontal line median; boxes extend to the quartiles and the whiskers show the range of the data (median-1.5* interquartile range (IQR); median+1.5*IQR). Data from 2 independent experiments. c, The DNA tension measured at encounters of loop-extruding cohesin with the N- and C-terminus of CTCF and dCas9. The stalling force values from panel (b) is shown for comparison. N = 297, 184, 37, 66 for CTCF (N), CTCF (C), dCas9 and the stalling force measurements, respectively. d, The empirical survival function (1-CDF) of the data shown in panel c. Thick line represents the mean; shaded areas represent 95% confidence intervals. At the DNA tension of complete stalling at the CTCF N-terminus, 0.14 pN, the survival function decays to 53 \(\pm \) 16%, i.e. if loops would be halted by reaching the stalling force alone, one would expect ~53% of loops to exceed the DNA tension of 0.14 pN, which was not observed (compare blue line for stalling at the CTCF N-terminus and Fig. 2g). e, Ratio of the N-terminal and C-terminal blocking probabilities. N-terminal encounters block loop extrusion 3.6 ± 0.8 -fold (The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval as depicted in Fig. 2g) more often than encounters from CTCF's C-terminal side, independently of DNA tension. N per bin for N-terminal (n) and C-terminal (c) encounters: 0.025-0.0415 pN: 70 (n), 72 (c); 0.0415-0.058 pN: 81 (n), 67 (c); 0.058-0.075 pN: 84 (n), 30 (c); 0.075-0.091 pN: 20 (n), 14 (c); 0.091-0.1075 pN: 40 (n), 6 (c); 0.119-0.142 pN: 3 (n), 0 (c). Sample sizes refer to biological replicates. f, Fraction of blocked molecules in the cohesin diffusion assay as a function of DNA tension (note that the DNA tension is constant in diffusion assays since no DNA loop is being extruded). The bar height denotes the mean, error bars denote the error propagation after multiplication, given the 95% binomial confidence interval. g, DNA tension of DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by N-terminally oriented CTCF (left; N = 74 from 2 independent experiments) or by C-terminally oriented CTCF (right; N = 27 from 5 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sided 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. h, Violin plot of DNA tension for DNA molecules on which diffusing cohesin was blocked by CTCF (left; N = 161 from 7 independent experiments) or repeatedly passed CTCF (right; N = 88 from 7 independent experiments). Statistical significance was assessed by a 2-sample Kolmogorov-Smirnoff test. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median./p>

 0.05, 2-sided 2-sample Kolmogorov–Smirnov test). i, Loop shrinkage rate, in comparison to cohesin loop extrusion rate (grey), and j, distribution of shrinkage time spans. Black dots represent step-wise shrinkage events that happen within one imaging time interval, i.e. 0.4 s. k, Absolute and l, relative loop size decrease for N- and C-terminal encounters in blue and red, respectively. Thick horizontal lines on boxplots denote median values, the box extends from the lower to upper quartile values and whisker limits denote the range of data within 1.5 times the interquartile range from the median. Data for N-/C-terminal encounters were collected from 13 and 3 independent measurements, respectively./p>