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Projetando agonistas de receptores com farmacocinética aprimorada, enxertando peptídeos macrocíclicos em regiões cristalizáveis ​​de fragmentos

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Projetando agonistas de receptores com farmacocinética aprimorada, enxertando peptídeos macrocíclicos em regiões cristalizáveis ​​de fragmentos

Natureza Engenharia Biomédica

Nature Biomedical Engineering volume 7, páginas 164–176 (2023) Cite este artigo

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Detalhes das métricas

Meias-vidas curtas em circulação e transporte deficiente através da barreira hematoencefálica limitam a utilidade de citocinas e fatores de crescimento que atuam como agonistas de receptores. Aqui, mostramos que os agonistas de receptores substitutos com meias-vidas mais longas em circulação e taxas de transporte aumentadas através da barreira hematoencefálica podem ser gerados pela inserção genética de farmacoforos peptídicos macrocíclicos nas alças estruturais da região cristalizável do fragmento (Fc) de uma imunoglobulina humana. Usamos essa abordagem de 'enxerto de laço', que preserva os níveis de expressão da região Fc e sua afinidade com o receptor Fc neonatal, para gerar andaimes de proteína baseados em Fc com peptídeos macrocíclicos que se ligam ao receptor de proteína tirosina quinase Met. Os agonistas do Met dimerizaram o Met, induzindo respostas biológicas semelhantes às induzidas por seu ligante natural. Além disso, o enxerto de laço da região Fc do anticorpo anti-receptor de transferrina de camundongo com peptídeos macrocíclicos de ligação a Met aumentou o acúmulo dos agonistas de Met resultantes no parênquima cerebral de camundongos. Lasso-enxertia pode permitir a terapêutica de proteína projetada com maior estabilidade e farmacocinética.

O uso clínico de citocinas e fatores de crescimento como terapêutica foi aprovado pela Food and Drug Administration1,2 dos Estados Unidos, e sua potencial aplicação em áreas emergentes, como neurogênese e reparo cerebral3,4, é tema de intensa pesquisa. No entanto, suas propriedades estruturais inerentes os tornam difíceis de projetar para melhorar a estabilidade físico-química e farmacocinética, em particular, para melhor meia-vida ou penetrância da barreira hematoencefálica (BBB). Os métodos existentes que controlam a farmacocinética da terapêutica protéica incluem a conjugação e fusão de poli(etilenoglicol) com a região cristalizável do fragmento (Fc) da imunoglobulina5,6,7 para estender suas meias-vidas; e fusão com Fab do anticorpo anti-receptor de transferrina (TfR) para aumentar sua penetração através do BBB8,9,10. No entanto, até que ponto esses métodos podem melhorar a farmacocinética das proteínas sem afetar adversamente suas bioatividades depende das propriedades de cada proteína5,6,7,8. Para superar as limitações estruturais inerentes das citocinas e dos fatores de crescimento, houve progresso no desenvolvimento de agonistas substitutos que não estão estruturalmente relacionados aos ligantes nativos11,12. Apesar desses avanços recentes, permanece uma grande necessidade não atendida de métodos mais robustos e versáteis para projetar terapias de proteínas com estabilidade físico-química e farmacocinética desejadas.

Os peptídeos macrocíclicos emergiram como uma nova classe promissora de candidatos a medicamentos com várias características desejáveis, como afinidade e especificidade de ligação semelhantes a anticorpos13,14, a capacidade de atingir espaços químicos únicos15,16,17,18 e descoberta eficiente por meio de métodos racionais /projeto computacional e exibição in vitro18,19,20,21. Em geral, os peptídeos macrocíclicos exibem maiores afinidades por alvos do que os peptídeos lineares devido às suas estruturas cíclicas restritas. Uma possibilidade intrigante de estender a aplicabilidade desses peptídeos macrocíclicos é "enxertá-los" em andaimes de proteína para permitir combinações funcionais de peptídeo e proteína18,22,23,24,25,26. No entanto, o enxerto de peptídeos identificados de novo em alças de proteína tem sido um desafio devido ao potencial mal dobramento do peptídeo enxertado e da proteína hospedeira26.

O desenvolvimento do sistema RaPID (descoberta integrada de peptídeos aleatórios não padrão), que integra exibição de RNA mensageiro e reprogramação de código genético, permitiu a descoberta de peptídeos macrocíclicos ciclizados baseados em tioéter com especificidade de ligação requintada contra proteínas-alvo16,17,18. Em estudos anteriores, mostramos que as sequências farmacoforas derivadas de RaPID podem ser facilmente implantadas em loops de proteínas expostas à superfície e manter ambas as funções do peptídeo convidado e da proteína hospedeira, que denominamos 'lasso-grafting'27,28,29 . A compatibilidade de enxerto excepcional observada provavelmente se deve à propriedade intrínseca dos motivos farmacóforos de se dobrarem na conformação de ligação ao alvo semelhante ao macrociclo parental, mesmo no contexto da estrutura de loop não relacionada das proteínas de andaime18,30.

 B1 > B2, which correlated well with their ability to activate cellular Met. The BS3-crosslinked 2:1 complex of MetECD and Fc(aMD4)B3 was purified by size exclusion chromatography (Extended Data Fig. 5c) and subjected to single-molecule examination by high-speed atomic force microscopy (HS-AFM)42, with Fc and MetECD as controls (Fig. 3c–f and Supplementary Videos 1–4). On HS-AFM, MetECD showed a globular Sema domain and Ig-like, plexins, transcription factors (IPT) stalk domains, with the relative positioning of each IPT domain being flexible (Fig. 3d and Supplementary Video 2). Fc(aMD4)B3 bound to the lower face of the Sema domain and bridged two Met molecules while having the IPT stalk domains sprayed away (Fig. 3e and Supplementary Video 3) or attached (Fig. 3f and Supplementary Video 4). The flexibility of IPT domains probably allows for the proper association of the intracellular kinase domains of two Met molecules, this association being essential for Met activation33,34. These results show that while Fc(aMD4)B3 binds to Met on a site different from that in HGF, its recruitment of two Met receptors in close proximity enables it to activate Met to the same extent as HGF./p>12 weeks, 19–24 g) given a single tail-vein injection or subcutaneous injection at 5.0 mg kg−1 for Fc(aMD4)B3, diluted in 100 µl PBS. Blood was drawn from the submandibular vein using a Goldenrod animal lancet (Bio Research Center) or from the orbital plexus at each time point, processed to serum and stored at −80 °C until analysis. The serum concentrations of Fc and Fc(aMD4)B3 were determined using a human immunoglobulin recognition immunoassay (human IgG ELISA quantitation set, Bethyl Laboratories). The serum concentrations of HGF were determined using an in-house developed ELISA. All animal experimental procedures were conducted in accordance with the guidelines provided by the Proper Conduct of Animal Experiments (1 June 2006, Science Council of Japan). The procedures were approved by the Institutional Review Board of Kanazawa University or the Laboratory Animal Ethics Committee of PhoenixBio./p>12 weeks, 15–21 g) were given a single subcutaneous injection at 5 mg kg−1 for Fc(aMD4)B3 in 200 µl PBS or control PBS. Forty-four hours after administration of Fc(aMD4)B3 or control PBS, 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) (Sigma Chemical) was intraperitoneally injected into chimeric mice at a dose of 100 mg kg−1 for 2 h before killing. Livers isolated from PXB-mice were treated with RNAlater for RNA-seq or prepared for BrdU staining. Formalin-fixed paraffin sections of chimeric livers were incubated with a rat anti-BrdU antibody at 3 µg ml−1 (Abcam, ab6326), followed by an Alexa Fluor 488-conjugated anti-rat IgG goat polyclonal antibody at 1 µg ml−1 (Abcam, ab150157). Nuclei were counterstained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Thermo Fisher) at 300 nM. Fluorescent images were obtained using Keyence BZ-X810. The number of BrdU-positive nuclei was determined by counting at least 15,000 cells in 20 randomly selected visual fields in sections from the lateral left lobe and medial right lobe per animal. The procedures involving humanized liver tissues were approved by the Utilization of Human Tissue Ethical Committee of PhoenixBio. All animal experimental procedures were conducted in accordance with the guidelines provided by the Proper Conduct of Animal Experiments (1 June 2006, Science Council of Japan). The procedures were approved by the Laboratory Animal Ethics Committee of PhoenixBio./p>