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Aug 04, 2023

Modificação eficiente e preparação de DNA circular para expressão em cultura celular

Volume de Biologia da Comunicação

Biologia das Comunicações volume 5, Número do artigo: 1393 (2022) Citar este artigo

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Os plasmídeos de DNA são uma ferramenta essencial para a entrega e expressão de RNAs e proteínas em experimentos de cultura de células. A preparação de plasmídeos normalmente envolve um laborioso processo de clonagem bacteriana, validação e purificação. Embora os plasmídeos de expressão possam ser concebidos e encomendados aos fabricantes contratados, o custo pode ser proibitivo quando é necessário um grande número de plasmídeos. Desenvolvemos um método e protocolo totalmente sintético eficiente que permite a produção de DNA circularizado contendo elementos de expressão prontos para transfecção em menos de 3 horas, eliminando assim as etapas de clonagem bacteriana. O protocolo descreve como pegar um fragmento linear de DNA de fita dupla e circularizar e purificar eficientemente esse fragmento de DNA com o mínimo de tempo prático. Como prova do princípio, aplicamos o vetor circular que expressa o RNA guia de edição principal projetado (epegRNA) em cultura de células e demonstramos o desempenho correspondente e até superior desse método em comparação com os guias expressos por plasmídeos. A velocidade de preparação, o baixo custo e a facilidade de uso do método o tornarão uma ferramenta útil em aplicações que requerem a expressão de RNAs curtos e proteínas.

Existem muitas técnicas para a preparação e entrega de RNAs e proteínas para expressão transitória em culturas de células1. Neste estudo, apresentamos um método de preparação novo e eficiente. Como demonstração, descreveremos o uso de nosso método no contexto de aplicativos de edição de genes. No entanto, como o princípio por trás desse método é genérico, esse método pode ser útil para uma variedade de propósitos e aplicações que requerem a expressão de RNAs e proteínas. Embora discutamos a implementação específica para edição de genes e comparemos nosso método com algumas técnicas de preparação existentes, o objetivo deste artigo é apresentar uma nova abordagem para preparar os vetores de expressão em um ambiente de laboratório - e não um método de edição de genes mais eficiente como tal.

As três abordagens mais comuns que facilitam a edição de genes quando entregues nas células são: (I) plasmídeos únicos ou múltiplos2 codificando Cas9 e outras proteínas suplementares e implementações de RNA guia adequado para CRISPR/Cas9 tradicional, edição de base, edição principal ou outros métodos3,4 ,5,6; (II) Cas9 mRNA e guia RNA7; (III) Proteína Cas9 complexada com RNAs guia8. Uma variedade de métodos de entrega das construções de edição de genes acima mencionadas está sendo usada atualmente. A escolha do método de entrega dependerá dos requisitos específicos e das preferências do pesquisador, que podem incluir eletroporação9,10, lipofecção11, transfecção física direta12, entrega de vetores em partículas de polímero e microcarreadores13 e modalidades dos métodos mencionados acima.

A abordagem (I), edição de genes usando transfecção de plasmídeo para expressão transiente é comumente usada devido à sua simplicidade conceitual, facilidade de manuseio e estabilidade dos plasmídeos. No entanto, a preparação de plasmídeos é um processo trabalhoso e demorado que normalmente leva 2 dias2 (consulte as etapas típicas de clonagem bacteriana na Nota Suplementar 1).

Desenvolvemos um método e protocolo totalmente sintético eficiente que permite a produção de DNA circularizado contendo elementos de expressão prontos para transfecção em menos de 3 h, eliminando assim as etapas de clonagem bacteriana. O DNA circularizado é resistente à degradação por exonuclease no citoplasma14. O DNA linear carece dessa estabilidade, o que é uma barreira significativa para utilizá-lo para a entrega de genes. Além disso, nosso método aproveita essa diferença de propriedades usando exonuclease para digerir fragmentos de DNA linear não reagidos ou mal reagidos, purificando assim o DNA circular.

Determinamos que a faixa prática do comprimento do vetor de expressão está entre 450 e 950 pb, onde atinge até 62% de eficiência na conversão de DNA linear de cadeia dupla (dsDNA) de entrada em vetores de expressão circulares; o método também pode ser usado com menor eficiência para fragmentos um pouco mais longos. Por brevidade, consistência e para evitar confusão com a descrição das etapas de preparação e do produto final neste artigo, vamos nos referir a esta construção e método de vetor de expressão de DNA circular como um Vetor Circular, em letras maiúsculas e em itálico.