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Aug 05, 2023

vacina

Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 1770 (2023) Citar este artigo

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A evolução direcionada em sistemas de exibição de bactérias ou leveduras tem sido usada com sucesso para melhorar a estabilidade e a expressão de receptores acoplados à proteína G para estudos estruturais e biofísicos. No entanto, vários receptores não podem ser abordados em sistemas microbianos devido à sua composição molecular complexa ou propriedades de ligantes desfavoráveis. Aqui, relatamos uma abordagem para desenvolver receptores acoplados à proteína G em células de mamíferos. Para obter clonalidade e expressão uniforme, desenvolvemos um sistema de transdução viral baseado no vírus Vaccinia. Por design racional de bibliotecas de DNA sintético, primeiro desenvolvemos o receptor de neurotensina 1 para alta estabilidade e expressão. Em segundo lugar, demonstramos que os receptores com arquiteturas moleculares complexas e grandes ligantes, como o receptor do hormônio paratireóideo 1, podem ser prontamente desenvolvidos. É importante ressaltar que as propriedades funcionais do receptor agora podem ser desenvolvidas na presença do ambiente de sinalização de mamíferos, resultando em variantes do receptor exibindo aumento do acoplamento alostérico entre o local de ligação do ligante e a interface da proteína G. Nossa abordagem, portanto, fornece insights sobre a intrincada interação molecular necessária para a ativação do GPCR.

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) compreendem a maior família de proteínas integrais de membrana e estão envolvidos na regulação de muitos processos biológicos1. Os GPCRs detectam uma grande variedade de ligantes, variando de pequenas moléculas a grandes proteínas, em seu lado extracelular. Para exercer sua função, os GPCRs amostram um continuum de estados conformacionais, resultando em níveis de nenhuma atividade a atividade máxima. Os ligantes estabilizam conformações distintas que mantêm o receptor em estado inativo (no caso dos agonistas inversos) ou ativo (no caso dos agonistas)2. A mudança conformacional induzida por um agonista na bolsa de ligação do ligante é transmitida para a superfície intracelular do receptor e resulta na ativação de proteínas G heterotriméricas pela troca de GDP por GTP na subunidade Gα. Como consequência, as subunidades Gα e Gβγ se dissociam e podem ativar processos de sinalização downstream3,4. Dada a sua ampla relevância fisiológica, os GPCRs são importantes alvos de drogas1, e a compreensão dos mecanismos de estrutura e função que levam à ativação de GPCRs é crítica para o desenvolvimento futuro de drogas. Embora a flexibilidade conformacional seja essencial para o funcionamento adequado do receptor, é um obstáculo para determinar experimentalmente as estruturas das proteínas. Esta tem sido a motivação de esforços substanciais de engenharia para tornar os GPCRs passíveis de estudos estruturais.

Anteriormente, elaboramos várias estratégias usando evolução direcionada para melhorar as propriedades biofísicas dos GPCRs5,6,7,8. A evolução dirigida visa acelerar o processo de evolução natural, ou seja, o enriquecimento de características desejáveis ​​que são codificadas em um conjunto de variantes genéticas, por meio de rodadas iterativas de diversificação e seleção de genes. Assim, a função da proteína pode ser alterada ou criada de novo e, assim, a evolução dirigida tornou-se um método poderoso para desenvolver novas ferramentas moleculares e terapêuticas, ainda aplicadas principalmente a proteínas solúveis. Para estender esta metodologia para GPCRs, foram utilizados organismos microbianos, como bactérias e leveduras. Por transformação com plasmídeos, eles podem ocupar, em média, uma cópia, de forma que, após o plasmídeo estabelecer seu número de cópias, cada célula microbiana ainda é "clonal". A expressão de GPCRs em forma funcional na membrana plasmática de levedura ou na membrana interna de E. coli foi demonstrada5,8,9 e, portanto, é garantido um acoplamento estrito de fenótipo e genótipo, o que é um requisito fundamental para a evolução direcionada. Além disso, altas taxas de transformação podem ser alcançadas em micróbios para representar eficientemente diversas bibliotecas de genes. Usando a seleção impulsionada pelo número de ligantes de ligação e, portanto, receptores funcionais na membrana, uma variedade de variantes de GPCR bem expressas e estáveis ​​foram geradas que foram instrumentais para estudos estruturais e projetos de descoberta de drogas10,11,12,13,14,15, 16,17.